低背景化學發光檢測試劑盒說明書
cECL Western Blot Kit
目錄號：K0048
保存條件：2-8℃避光保存。
本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途產品簡介
低背景化學發光檢測試劑盒是免疫印跡實驗中與辣根過氧化物酶（HRP）配套使用
的的低背景底物檢測試劑盒。本產品能夠在HRP的催化下發生化學反應而發光，可用于
檢測固定在膜上的蛋白質等生物大分子。其高靈敏度能夠檢測ng級別的抗原，發光信號
強烈持久，可以使用照相技術（X-光膠片曝光）或者其他成像方法（如熒光或化學發光
成像儀）進行檢測。
注意事項
1. 為獲得zui佳實驗結果，請務必優化實驗條件，包括檢測樣品的用量、一抗、二抗稀
釋度、雜交膜及封閉試劑的選擇，抗體孵育及膜洗滌步驟中請使用搖床輔助完成。
2. 由于奶粉中含有內源性生物素，在使用親和素/生物素系統時，封閉液中應避免使用 奶粉。
3. 免疫印跡實驗進行全過程中，使用充足的洗滌緩沖液、封閉液、抗體稀釋液和底物
反應液以*覆蓋印跡，確保印跡膜始終處于濕潤狀態，避免干燥。使用大量的封
閉液和洗滌液，可以降低非特異信號。
4. 由于疊氮鈉是HRP抑制劑，在緩沖液中應避免使用疊氮鈉作為防腐劑。
5. 在與膜發生接觸過程中，請佩戴手套且使用干凈鑷子等潔凈器材，避免蛋白污染及
高背景。
6. 避光條件下，配制好的化學發光檢測底物工作液可在室溫下穩定保存8小時。陽光
或其他強光會影響工作液，故應避免強光長時間的照射。正常實驗室燈光短時間照射不影響工作液的使用。
7. 上海研謹提供多種蛋白轉移用膜、封閉液、一抗、酶標二抗、緩沖液等，詳情請查
詢目錄或網站。
操作步驟
注意：務必使用推薦的抗體稀釋濃度以獲得陽性結果，zui佳抗原和抗體用量須通過預
實驗來確定。
1．二抗孵育完畢后，將印跡膜充分洗滌。
2．根據需要量，將增強型發光劑和穩定劑按照1：1的比例等體積混合，配制為化學發
光檢測底物工作液（例如：一張8 cm×6 cm的膜使用1 ml工作液）。
3．棄去洗滌緩沖液，將發光底物工作液滴加在印跡膜上，確保工作液覆蓋整張膜，室
溫孵育3-5分鐘。
4．用移液器吸去多余發光底物工作液，將印跡膜置于兩層干凈的塑料薄膜之間，此過
程應小心完成，避免膜與膜之間產生氣泡。
5．在暗室內進行X-光膠片曝光，或將膜放置到熒光、化學發光成像儀內，按照儀器說
明書進行檢測。
注意：一抗推薦用量為50 ng/ml-1 μg/ml，二抗推薦用量為5 ng/ml-50 ng/ml。
相關實驗材料
K0043 TBST(TBS with Tween-20，pH8.0) K0058 NC膜(0.45μm)
K0052 蛋白示蹤上樣緩沖液（還原） K2002 NC膜(0.22μm)
K0053 蛋白示蹤上樣緩沖液（非還原） K0059 PVDF膜(0.45μm)
K0054 WB封閉液I（BSA） K2003 PVDF膜(0.22μm)
K0055 WB封閉液II（奶粉） K0060 X線暗盒
K0056 蛋白印跡膜再生液 K0061 X光膠片
K0057 麗春紅染色液 K0062 定影粉
K0044 Tris Glycine轉膜緩沖液 K0063 顯影粉
常見問題解答
問題
1.膠片反相（白色條帶，黑色背景）
2.膜上出現棕色或黃色條帶
3.暗室中看到強烈發光
4.發光信號持續時間過短
可能原因： 系統中HRP過量
解決方法：稀釋HRP標記物至少10倍以上
問題：信號較弱或者無信號
可能原因：
a發光反應系統中HRP過多，消耗稀釋底物過快，引起信號迅速降低
b抗原/抗體量不夠
c蛋白轉移率低
解決方法：
a稀釋HRP 標記物至少10倍以上
b增加抗原/抗體使用量
c優化轉移系統
問題：高背景
可能原因：
a系統中HRP過量
b 封閉不足
c 封閉試劑選擇不當
d 沖洗不充分
e曝光過度
f抗原/抗體濃度過高
解決方法：
a稀釋HRP標記物至少10倍以上
b優化封閉程序
c選擇另一種封閉試劑
d增加沖洗時間，次數
e減少曝光時間
f降低抗原/抗體使用濃度
問題：蛋白條帶為點狀
可能原因：
a蛋白轉移失敗
b膜未平衡
c膠片與膜之間有氣泡
解決方法：
a優化轉移過程
b按照說明書處理膜
C曝光前去除所有氣泡
問題：出現非特異條帶 （高背景、信號維持時間較短）
可能原因：系統中HRP過多
解決方法：稀釋HRP標記物
問題： 出現非特異條帶（背景干凈信號維持時間正常）
可能原因：
1. 一抗用量過多
2. SDS導致非特異結合
解決方法：
1.進一步稀釋一抗
2. 在實驗過程中避免使用SDS
使用本產品的文獻
Lu X, Zhang N, Meng B, et al. Involvement of GPR12 in the regulation of cell proliferation and survival. Mol Cell
Biochem. 2012 Mar 20
He J, Kang L, Wu T, et al. An elaborate regulation of mTOR activity is required for somatic cell reprogramming
induced by defined transcription factors. Stem Cells Dev. 2012 Apr 3
Lu X, Zhang N, Dong S, et al. Involvement of GPR12 in the induction of neurite outgrowth in PC12 cells. Brain
Res Bull. 2012 Jan 4;87(1):30-6.
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